［文献解读］ctDNA与克隆进化

Multifocal clonal evolution characterized using circulating tumor DNA in a case of metastatic breast cancer
Nat Commun      Nov 2015

文章概述
1.对1位乳腺癌患者（ER+, HER2+）进行了长达3年的治疗和随访
2.对8处肿瘤组织和9份血浆突变进行了突变检测、分析和比较
3.利用肿瘤组织和血浆ctDNA突变基因描绘了肿瘤的克隆进化
4.追踪ctDNA基因突变的动态变化实时监测治疗效果
文章亮点
1.对多组织和多时间节点的血浆突变进行全面分析比较
2.利用多组织特有的突变基因绘制进化树，反映肿瘤克隆进化顺序
3.追踪ctDNA主干、枝干突变和肿瘤组织特有基因动态变化，监测治疗效果
研究意义
组织活检和液态活检比较发现，ctDNA能够反映肿瘤治疗过程中的克隆进化，用于实时监测用药效果，进而辅助制定和调整临床治疗策略，使患者受益
主要内容
1.研究背景
2.临床案例情况
3.基于多处肿瘤组织基因突变的克隆结构（clonal structure）推断
4.基于ctDNA连续监测的克隆结构分析与肿瘤组织中的比较
5.讨论
研究背景
1.肿瘤异质性限制靶向治疗在转移性肿瘤中的应用
2.外周血ctDNA检测能够反映转移性肿瘤的空间异质性
3.外周血ctDNA连续性监测能够追踪肿瘤负荷并反映治疗过程中的克隆进化（clonal evolution）
4.通常的研究只针对某一处肿瘤组织和血浆的情况进行比较
5.本文采用多处肿瘤组织和连续地血浆样品更好地分析肿瘤异质性和克隆进化
临床案例情况

图 1 a 肿瘤组织样品收集情况 P (原发primary)，M (转移metastasis)
患者的基本情况：42岁女性DCIS患者，初诊时淋巴结转移，骨、胸膜、肝转移
肿瘤组织样品收集：取3个时间节点8处肿瘤组织样品
第1个节点（组织活检时）：原发灶（P1.1）和同侧淋巴结（P1.2）
第2个节点（发现脑转移时）： 脑转移（M2.1）
第3个节点（死亡后）： 原发灶（P3.1）、胸壁（M3.1）、肝脏（M3.2）、卵巢（M3.3）和脊椎（M3.4）
治疗和样品收集过程

图1b 临床病程、血浆和组织样品采集及治疗的时间轴
取3个时间节点8处肿瘤组织样品
Day 5：肝损伤和胸腔积液（化疗）
Day 577：脑转移（手术）
Day 700：肝损伤加重卵巢转移（化疗联合靶向治疗）
Day 1077：全面恶化（停药）、死亡
基于多处肿瘤组织基因突变的克隆结构推断
克隆结构分析流程

克隆结构分析

图 1 c 突变在肿瘤组织中的分布和克隆结构划分
第1个簇（cluster）：包括23个突变，在原发和所有转移灶都有检出
第2个簇：包括26个突变，在所有转移灶都有检出，是转移灶特有的
第3-10个簇：包括126个突变，是某些病灶特有的，cluster 3是P3.1特有， cluster 4/5是M3.1特有， cluster 6是M2.1特有，cluster 4/5是M3.2特有
肿瘤进化模式分析

图 1 d 肿瘤进化树
根据高可信的突变在各个肿瘤组织中的分布情况绘制
由正常组织进化到原发灶： 发生了23个基因突变
由原发灶进化到各个转移灶： 发生了26个基因突变
各个病灶继续进化：  例如，胸壁（M3.1）携带70个特有    基因突变
细胞频率分析

图 1 e 每个簇在肿瘤组织中的细胞频率（cellular frequency ）
Cluster 1的细胞频率在各个肿瘤组织中维持在接近1.0的水平
Cluster 2的细胞频率在所有转移灶中维持在较高的水平
Cluster 3的细胞频率在P3.1中最高， Cluster 4/5的在M3.1中最高， Cluster 6和7分别是M2.1和M3.2
基于ctDNA连续监测的克隆结构分析与肿瘤组织中的比较
ctDNA细胞频率分析

图 2 b 按ctDNA计算的每个簇的细胞频率
Cluster 1的细胞频率在各个节点（T1-T9）的血浆样品中最高，维持在接近1.0的水平
Cluster 2的细胞频率在各个节点也维持在较高的水平，低于Cluster 1
Cluster 3、4/5的细胞频率在各个节点维持在较低的水平
ctDNA和组织分簇比较

图 1 c 将血浆中检测的突变按肿瘤组织中的方式分簇，比较血浆和肿瘤组织主干克隆和枝干克隆的cluster
ctDNA能够检测出肿瘤cluster1和2 中的所有突变
ctDNA不能反映转移灶特有突变在组织中的分布情况
ctDNA在连续监测过程中能够反映转移灶特有突变的整体变化情况

ctDNA鉴定的血浆Cluster 1和2，虽然与组织的Cluster 1和2划分有细微差别，但两者基本是重叠的，说明ctDNA鉴定能够很好地反映组织的主干和枝干克隆的突变情况
ctDNA与疗效监测

图 2 a 主干和枝干基因突变频率在用药疗效监测中应用
红色箭头标示时间点有CT结果，700-804天时病情被控制，第1077天CT显示全面恶化
他莫昔芬和曲妥珠单抗治疗时： 主干和枝干基因突变频率的平均值的上升能够反映耐药性的出现
拉帕替尼和卡培他滨治疗时： 主干和枝干基因突变频率的平均值先下降后上升反映了该方案初期的有效性和后期耐药性的出现
说明通过ctDNA连续监测主干和枝干基因突变情况能够反映用药的效果，较CT提前发现病情进展

图 2 c 肿瘤组织特有突变在血浆中的含量变化情况
他莫昔芬和曲妥珠单抗治疗时： 组织特有的基因突变在血浆中的含量无上升，反映了耐药的出现与它们无关
拉帕替尼和卡培他滨治疗时： 组织特有的基因突变在血浆中的含量变化，其中M3.1的量在T4-T9中不断上升，反映了耐药的出现与M3.1的特有突变有关

图 2 d ERBB4 (p.H809G) 和PIK3CA (p.E542K)基因突变频率的动态变化
PIK3CA基因突变： 仅仅在血浆检测中发现，组织中没有检出，前期在血浆中的突变频明显上升，可能与他莫昔芬和曲妥珠单抗治疗时的耐药有关，而后被拉帕替尼抑制
ERBB4基因突变： 属于M3.1特有的突变，用拉帕替尼和卡培他滨时，该突变已有低频检出，而出发现全面恶化时，突变频率已经上升至约12%，实际在T5时已经出现频率上升的现象，抗HER2治疗的耐药性很可能与ERBB4旁路激活有关
讨论
1. Analysis of ctDNA reflects the clonal hierarchy determined from multiregional tumor sequencing and tracks different treatment responses across metastases.
2. For monitoring tumor burden using ctDNA, stem mutations are the best candidates, as they are highest in circulating.
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